知识源于沉淀 一、探针制备
目的:用生物素标记的引物对HIF1A基因的启动子序列进行fish，并以此为探针进行DNA下拉。
2实验材料
l主要试剂
l主要仪器设备
3基因和载体信息
启动子:HIF1A
物种:人类
agcctggccaacaatggtgaaaacctcgtctcttactaaaaaaaaattatccgagtgtggtgtggtgcgcgtgcctgtaatcagcttgggaggcaggagattacatcttgtacctgggaggcgaggttgcagtgaggcaggtagccaatcgtgtggccaggcgaggcggcgcgcgcgccggcgccagtggggggcgagcgagcgatgcgatgtgtggaggcaggcaaaaaaatatatataaatatatatatataaatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatataggc
l引物序列
表1生物素PCR引物序列
4实验方法
l目的片段的PCR扩增
表2 PCR反应条件
表3 PCR反应系统
全长基因片段的获得、纯化和回收(DNA回收试剂盒，天根:DP214-02)。以ARG2启动子质粒为模板，用F/R引物PCR扩增目的基因，1.5%琼脂糖凝胶电泳，90V，30min检测。
胶水回收
1.柱平衡:在吸附柱CB2中加入500 l平衡液BL(吸附柱放在收集管中)。
以12,000rpm离心1分钟，倒出废液，将吸附柱放回收集管中。
2.从琼脂糖凝胶上切下一条感兴趣的DNA带，放入干净的EP管中，称重。
3.向橡胶块中加入等体积的PC溶液，在50℃的水浴中静置约10分钟，使橡胶块充分溶解。
4.将上一步所得溶液加入吸附柱CB2中，以12,000rpm离心1分钟，倾倒废液，将吸附柱CB2放入收集管中。
5.向吸附柱中加入600μl冲洗液PW，以12,000rpm离心1分钟，倾倒废液，将吸附柱CB2放入收集管中。
6.重复步骤5。
7.将吸附柱CB2放入收集管中，以12,000rpm离心2分钟，将吸附柱在室温下放置3分钟。
8.将吸附柱CB2放入新的离心管中，将30μl洗脱缓冲液EB滴入吸附膜中间位置，室温放置2min，12,000rpm离心1min，收集DNA溶液。
5实验结果
l探针PCR扩增琼脂糖凝胶图谱
马克笔:DL2000
探针:靶基因的启动子区
2.DNA下拉实验
目的:用生物素标记的探针捕捉细胞内与启动子区相互作用的蛋白质；并用质谱鉴定。
2实验材料
l主要试剂
l主要仪器设备
3实验方法
L-链霉素亲和磁珠与生物素标记的DNA的结合
1.磁珠的准备:用洗脸盆I 500l将磁珠洗3遍。
2.用洗涤缓冲液I重悬磁珠(配方如表2-3所示)，然后加入生物素标记的DNA探针，4℃过夜。
3.以3000rpm离心过夜混合物1分钟，并除去上清液。
4、洗涤缓冲液I冲洗3次。
表2-3清洗缓冲液配方
l磁珠复合物与蛋白质结合
1.向磁珠(作为系统的阴性对照)和磁珠-DNA混合物中加入细胞裂解液(约1mg蛋白质)，室温下翻转1小时。
2.将孵育后的珠蛋白混合物放在磁架上3min进行磁分离，去除上清液，用Wash BufferII洗涤3次，每次1ml。
SDS-PAGE凝胶电泳
向样品中加入5×SDS上样缓冲液，95℃变性10分钟，进行SDS-PAGE凝胶电泳。
l银染
1.固定:电泳后将凝胶放入约100ml的固定液中(配方见表2)，室温下在摇床上以60-70rpm的摇动速度摇动20分钟。
表2静态液体配置
乙醇
50毫升
乙酸
10毫升
ddH2O
40毫升
总数
100毫升
2.30%乙醇洗涤:弃去固定液，加入100ml 30% 30%乙醇，室温下在摇床上以60-70rpm的摇动速度摇动10分钟。
3.水洗:弃去30%乙醇，加入200ml双蒸水，室温下在摇床上以60-70rpm的摇动速度摇动10min。
4.敏化:弃去水，加入100ml银染料敏化液(1X)，在摇床上室温摇匀2分钟，摇匀速度为60-70rpm。
5.水洗(共两次):弃去原液，加入200ml双蒸水，室温下在摇床上以60-70rpm的摇动速度摇动1分钟。
6.重复步骤5
7.银染:弃去水分，加入100ml银溶液(1X)，室温下在摇床上以60-70rpm的摇动速度摇动10分钟。
8.水洗:弃去原溶液，加入100ml双蒸水，室温下在摇床上以60-70rpm的摇动速度摇动1-1.5分钟。
9.显色:弃去水分，加入100ml银染显色液，在摇床上室温摇匀3-10分钟，直至出现理想的预期蛋白带，摇匀速度为60-70rpm。
10.终止:弃去银染显色液，加入100ml银染终止液(1X)，室温下在摇床上以60-70rpm的摇动速度摇动10min。
11.水洗:弃去银染终止液，加入100ml双蒸水，室温下在摇床上以60-70rpm的摇动速度摇动2-5分钟。保存在双蒸水中。
4实验结果
l银染结果
L WB验证结果
项目的内容
广州如算生物科技有限公司成立于2016年，一直致力于探索科学，服务客户。致力于为高校、科研院所、医院、医药企业提供全面、便捷、专业的技术服务和产品。技术上，我们专注于生物医药领域:公司拥有完善的技术服务平台，涵盖分子生物学、转录组学、代谢组学、蛋白质组学、表观遗传学等科研平台。在产品方面，自主研发了COIP、CHIP、RIP等20多种科研试剂盒，与同类型进口试剂盒相比，大大降低了科研成本。
微信官方账号:如期。
关注我们，解决头号技术难题！！！
