pod酶活性测定方法 pod酶

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1、求教植物叶片POD酶活性的大致范围酶活性测定的原理：超氧物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性的测定 SOD采用氮蓝四唑（nitro-blue tetrazolium，NBT）法（Beauchamp和Fridovich，1971）。

2、反应步骤为：取200μl粗提液，加入3.7 ml NBT反应液50mmol/LpH7.8的磷酸缓冲液（PBS）配制的含77.12μmol/L氮蓝四唑, 100μmol/LEDTA－Na2和13.37mmol/L甲硫氨酸溶液〕，在30℃下保温2分钟后加入100μl核黄素溶液（pH7.8的50mmol/L磷酸缓冲液中含80.2μmol/L 核黄素和100μmol/LEDTA－Na2），在4000Lx日光下反应20min。

3、然后迅速测定A560。

4、以不照光的管做空白。

5、用酶标仪进行测定时按比例调整为总反应体积为400μL。

6、酶活性按以下公式计算：以抑制NBT光化还原的50％为一个SOD活性单位，结果以U/mg蛋白表示。

7、以加缓冲液代替酶液的作为对照。

8、SOD总活性＝(Ack－AE)×V/(Ack×0.5×W×Vt) 式中， Ack为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积（ml）；Vt为测定时样品用量（ml）；W为样品鲜重（g）或蛋白质含量（mg）。

9、过氧化氢酶（Catalase，CAT）活性测定 CAT 活性参照Aebi (1984)[7]的方法进行测定。

10、用酶标仪进行测定时按比例调整为总反应体积为400μL 。

11、400 μL反应液含50 mmol/L的PBS (pH 7.0)，30 mmol/L的H2O2和50 µL粗酶液。

12、反应从加入过氧化氢开始计时，连续测定在240 nm吸光度的降低值。

13、酶活性定义为：一个过氧化氢酶单位相当于在规定条件下于温度25℃，pH7.0条件下1分钟分解1μmol过氧化氢所需酶量，结果以U/mg蛋白或U/g鲜重表示。

14、多酚氧化酶（Polyphenoloxidase，PPO）活性的测定 PPO活性测定采用邻苯二酚法（Aquino-Bolaños和Mercado-Silva，2004）。

15、用酶标仪进行测定时按比例调整为总反应体积为400μL。

16、350µL反应液（用50mmol/L，pH6.4的PBS配制，内含100µmol/L邻苯二酚）中加入50 µL的粗酶液，平衡1分钟后连续测定398nm吸光度的变化。

17、以1分钟内398nm吸光度上升0.01为一个酶活性单位，结果以U/mg蛋白或U/g鲜重表示。

18、过氧化物酶（Peroxidase，POD）活性测定POD活性测定采用愈创木酚法（Lurie等，1997)。

19、用酶标仪进行测定时按比例调整为总反应体积为400μL。

20、反应体系为30μL粗酶液，290 µL 0.3%愈创木酚（用50 mmol/L的PBS配制，pH 6.4）和 80µL0.3%H2O2（用50 mmol/L的PBS配制，pH 6.4）。

21、反应在加入H2O2 后开始准确记时。

22、连续吸光度在470 nm的上升值。

23、酶活性以每分钟上升0.01为一个单位，结果以U/mg蛋白或U/g鲜重表示。

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