rtpcr操作流程 rtpcr

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1、原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。

2、再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。

3、该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。

4、RT- PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）即逆转录PCR，是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。

5、首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。

6、RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。

7、作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。

8、无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组 DNA的污染。

9、用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物中的一种。

10、对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。

11、扩展资料反转录酶的选择Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。

12、最适作用温度为37℃。

13、2、禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。

14、最适作用温度为42℃。

15、3、Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。

16、4、MMLV反转录酶的RNase H突变体：商品名为SuperScript 和SuperScriptⅡ。

17、此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。

18、参考资料：百度百科——RT -PCR。

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