northern(northan)

[实验目的]

(1)掌握Northern杂交原理。

(2)掌握利用Northern杂交检测目的基因表达差异的方法和操作步骤。

(3)掌握RNA变性电泳的操作流程。

【实验原理】Northern杂交主要用于检测细胞或组织样本中是否存在与探针同源的RNA分子，从而判断基因是否表达以及在转录水平表达多少。所以实验过程很像Southern杂交。Northern杂交电泳在变性条件下进行，去除RNA分子的二级结构，保证RNA按照分子大小完全分离。变性电泳有三种:乙二醛变性电泳、甲醛变性电泳和羟甲基汞变性电泳。本实验采用甲醛变性电泳。电泳后，用与Southern杂交相同的方法将RNA转移到尼龙膜上，然后与探针杂交。

[实验材料、试剂和仪器]

1.实验材料的总RNA溶液。

2.实验试剂

(1) 0.1% DEPC-H2O:将1毫升DEPC加入1000毫升去离子水中，37℃搅拌过夜，121℃高压灭菌20分钟。

(2)10×MOPS电泳缓冲液:取41.8g MOPS于700ml 0.1% DEPC-H2O中，调节pH值至7.0，加入20ml 1mol/L乙酸钠和20ml 0.5mol/L EDTA(pH 8.0)，用0.1% DEPC-H2O调节至1L，过滤，灭菌。

(3)10×甲酰胺上样缓冲液:0.5mol/L EDTA(pH8.0)，10mg溴酚蓝，10mg二甲苯，10mL去离子甲酰胺。

(4)其他试剂与Southern杂交实验中的试剂相同，但制备的溶液需经DEPC处理。

(5)β-肌动蛋白基因的地高辛标记探针:序列为5’-augccaucugcgucug-3’。

(6)C-myc癌基因的地高辛标记探针:序列为5’-gggcuuuaucuaacugcugua-3’。

3.实验仪器

混合炉(全班1台)

电泳仪(每8人一台)

振荡器(每8个人一个)

离心机(每8人一台)

恒温烘箱(全班1个)

或相机凝胶成像分析系统(全班1个)

瓷盘(每8人一套)

尼龙膜(每4人1卷)保鲜膜(每8人1卷)

3毫米Whatman滤纸(每4人一张)

吸水纸

普通滤纸

[实验步骤]

1.制备RNA变性凝胶

(1)制备50毫升含2.2摩尔/升甲醛的1%琼脂糖凝胶:称取0.5克琼脂糖，加入36毫升DEPC-H2O中，然后将5毫升10×MOPS电泳缓冲液和9毫升去离子甲醛混合制成凝胶。

(2)RNA样品的预处理:电泳前，将20μg RNA与2μL 10×MOPS电泳缓冲液、4μL甲醛和10μL甲酰胺混合，65℃孵育30分钟，冰浴冷却10分钟，然后加入2μL甲酰胺加样缓冲液。

(3)在电泳槽中加入1×MOPS电泳缓冲液，50V预电泳5min，将RNA样品加入凝胶上样孔，然后50V电泳至溴酚蓝移至凝胶前方，关闭电源。

2.凝胶转移

(1)电泳结束后，将凝胶转移到瓷板上，用0.1%的DEPC-H2O冲洗数次，用刀片将凝胶边缘无用的部分(包括加样孔上方的凝胶)修剪掉，在凝胶左下角切下一个小角做标记。

(2)将凝胶中10倍体积的变性溶液加入瓷盘中，室温放置45min，轻轻摇动。

(3)将凝胶短时间浸泡在0.1% DEPC-H2O中，然后将凝胶浸泡在10倍凝胶体积的中和缓冲液中，室温放置30分钟，轻轻摇匀；更换一次中和缓冲液，继续浸泡15分钟。

(4)在浸泡的过程中，先准备好改良后的转印膜，用干净的刀片剪下一张尼龙膜，每边比凝胶大1mm，再剪下两张与膜同样大小的Whatman滤纸。

(5)用刀片切掉薄膜待转移的一角，然后将薄膜浸入0.1%的DEPC-H2O溶液中，完全浸泡5min以上。

(6)将一张Whatman滤纸放在玻璃板上，滤纸两端从玻璃板上垂下，放入装有转移缓冲液(10×SSC)的容器中(见图9.1)。滤纸被转移缓冲液完全浸湿后，用玻璃棒驱赶气泡。

(7)将步骤(3)中的凝胶取出并倒置，置于滤纸中间，用保鲜膜将凝胶包裹，防止液体直接从液体池流到凝胶上方的吸水纸上。

(8)用适量的转移缓冲液打湿凝胶，将湿膜覆盖在凝胶上，切角对齐，赶走气泡。然后将湿的Whatman滤纸放在薄膜上，也可以赶走气泡。

(9)剪一叠比Whatman滤纸略小的吸水纸(约5 ~ 8 cm厚)，把吸水纸放在Whatman滤纸上，吸水纸上面放一个玻璃板，然后压一个重物，吸水8 ~ 24小时。在转移过程中，应根据情况及时更换吸水纸。

(10)转移后，用铅笔标记，转移到6×SSC中，冲洗5min，然后将膜转移到普通滤纸上，沥干多余的液体，将膜的RNA面朝上放在干燥的普通滤纸上几分钟，然后用254nm紫外光照射1.75min

交叉

(1)将膜放入6×SSC中，浸泡2分钟，然后放入杂交管中，加入预杂交液，放入杂交炉中，68℃密封6小时。

(2)探针预先在沸水中热变性5min，然后迅速放入冰浴中冷却。然后，用预杂交液(5 ~ 25ng/ml)稀释探针，加入杂交管，在68℃杂交过夜。

(3)将膜从杂交管中取出，置于含数百毫升2×SSC和0.5%SDS的皿中5min，室温下在缓慢旋转的平台上轻轻摇动皿5分钟。重复此步骤一次。

(4)将膜放入盛有数百毫升2×SSC和0.5%SDS的皿中，在42℃缓慢旋转的平台上轻轻摇动皿15分钟。重复此步骤一次。

(5)将浸泡液换成0.1×SSC和0.1%SDS，65℃放置0.5 ~ 4小时，轻轻摇匀，然后用0.1×SSC在室温下洗膜。

4.检测参考实验19“实验步骤”4。

【实验注意事项】

(1)含有甲醛的凝胶需要在RNA转移之前用DEPC处理的水冲洗几次以除去甲醛。

(2)同“实验19中的注意事项”的(1)～(9)。

【典型实验结果分析】理想实验结果(见图9.3)肿瘤细胞经不同浓度的抗肿瘤药物处理后，C-myc癌基因的表达随着抗肿瘤药物浓度的增加而降低，而作为参照的β-肌动蛋白基因的表达无明显变化。

图9.3 Northern杂交结果1 ~ 4:抗肿瘤药物处理后的基因表达产物，1→4泳道的抗肿瘤药物浓度依次增加。

【实验讨论】问题:琼脂糖的浓度高或者待分析RNA的相对分子量大时应该怎么办？

答:需要将凝胶在0.05mol/L NaOH中浸泡20min，使RNA部分水解，提高转移效率。浸泡后，凝胶用0.1% DEPC-H2O冲洗，在20×SSC中浸泡45min，然后转移到滤膜上。